Image Intensity Processing Lysstyrke er den visuelle oppfatningen av reflektert lys. Økt lysstyrke refererer til bilder økt luminans. Kontrast er adskillelsen av de letteste og mørkeste delene av et bilde. En økning i kontrast vil mørke skygger og lysere høydepunkter. Økende kontrast brukes vanligvis til å gjøre objekter i et bilde mer skilleverdige. Juster lysstyrken og kontrasten med Image Adjust BrightnessContrast. for å gjøre visualiseringen av bildet enklere. Trykk på Auto-knappen for å bruke en intelligent kontraststrekning til bildedisplayet. Lysstyrke og kontrast justeres ved å ta hensyn til bildens histogram. Hvis du trykker flere ganger, øker knappen prosentandelen av mettede piksler. Tilbakestill-knappen gir maksimalt 0 og minimum 255 i 8-biters bilder og maksimum og minimum lik de minste og største pixelverdiene i bildehistogrammet for 16-biters bilder. Hvis den automatiske knappen ikke gir et ønskelig resultat, kan du bruke området av interesse (ROI) til å velge en del av cellen og litt bakgrunn, og deretter trykke på Auto-knappen igjen. Strekningen vil da bli basert på intensiteten i avkastningen. Hvis du trykker på Bruk-knappen, endres de faktiske gråverdiene for bildet permanent. Hvis du bare analyserer bildens intensitet, ikke trykk på denne knappen. Hvis du foretrekker at bildet skal vises som svart på hvitt i stedet for hvitt på svart, bruk deretter omvendt kommando: Bildeoppslagstabeller Inverter LUT. Kommandoen Rediger omvendt omdirigerer pikselverdiene seg permanent. Få intensitetsverdier fra enkelt ROI Hvis du arbeider med en stabel, kan ROI-verdien analyseres med kommandoen: Image Stacks Plot Z Axis Profile. Dette genererer en enkelt kolonne med tall - en skiveintensitet per rad. De øverste 6 radene i kolonnen er detaljer om avkastningen. Dette sikrer at samme avkastning ikke analyseres to ganger, og lar deg lagre interessante ROI. Detaljerne består av område, x-koordinat, y-koordinat, AR, rundhet og soliditet av avkastningen. Hvis avkastningen er en ROI-verdi i stedet for en squaregtoval, virker det som om avkastningen er en ovalgtsquare. Den (ovale) avkastningen kan gjenopprettes ved å skrive inn detaljene som blir bedt om ved å velge Edit Selection Restore Selection (hurtigtast: Ctrl Shift E). Resultatene vises i et plottevindu med avkastningsdetaljene i plottvinduets tittel. Plottet inneholder knappene Liste, Lagre, Kopier. Kopier-knappen setter dataene i utklippstavlen slik at den kan limes inn i et Excel-ark. Innstillingene for kopieringsknappen finner du under Rediger alternativer for profilplottalternativer. Anbefalte innstillinger inkluderer: Ikke lagre x-verdier (forhindrer at skive nummerdata blir klistret inn i Excel) og Autoclose slik at du ikke må lukke det analyserte plottet hver gang. Dynamisk intensitet vs Tidsanalyse Plugin Plot Z Axis Profile (dette er Z Profiler fra Kevin (Gali) Baler (gliblr at yahoo) og Wayne Rasband rett og slett omdøpt) vil overvåke intensiteten til et flytende avkastning ved hjelp av et partikkelsporingsverktøy. Dette verktøyet kan enten være manuell eller automatisk. Bruk kommandoen Image Stacks Plot Z Axis Profile. Få intensitetsverdier fra flere ROIer Du kan analysere flere avkastningene samtidig med Bob Doughertys Multi Measure plugin. Den innfødte ROI-lederfunksjonen gjør en lignende jobb, men ikke genererer resultatene i sorterte kolonner. Sjekk Bobs nettsted for oppdateringer. Multi-plugin-modulen som følger med installasjonen, er v3.2. Åpne konfokalserier og fjern bakgrunnen (Se Bakgrunnskorrigering) Generer en referansestabel for tillegg av avkastning. Bruk Image Stacks Z-prosjektfunksjonen og velg gjennomsnittet. Gi nytt navn til dette bildet noe minneverdig. Åpne plugin for avkastning av avkastningstjener (Analyser verktøylinjeadministrator eller verktøylinjeikon). Velg avkastning og legg til i avkastningshåndteringen. Klikk på Vis alle-knappen for å unngå å analysere den samme cellen to ganger. Etter at du har valgt ROI som skal analyseres i referansebildet, kan du tegne dem til referansebildet ved å klikke på Moregtgt-knappen og velge Tegne. Lagre referansebildet til eksperimentdatamappen, og klikk deretter på stakken som skal analyseres. Klikk på Moregtgt-knappen i avkastningsbehandleren, og velg Multi-måle-knappen for å måle alle avkastningene. Klikk Ok. Dette vil sette verdier fra hver skive inn i en enkelt rad med flere kolonner per skive. Ved å klikke på Mål alle 50 skiver, legger alle verdier fra alle skiver og hver avkastning i en enkelt kolonne. Gå til resultatvinduet og velg menyelementet Rediger velg alt. . Deretter EditCopy. Gå til Excel og lim inn dataene. Kontroller at alt ble limt inn riktig 10. For å kopiere avkastningskoordinater til Excel-regnearket, må det være en tom rad over intensitetsdataene. Bruk dialogboksen Multi Measurement og klikk på Copy List-knappen. 14. I Excel klikker du den tomme cellen over den første datakolonnen og limer inn i avkastningskoordinatene. Lagre avkastningene ved å lagre Multi Measure-knappen. Sett dem i den eksperimentelle datamappen. Avkastningene kan åpnes senere enten individuelt med knappen Åpne eller alt på en gang med knappen Åpen alle. Ovale og rektangulære ROIer kan gjenopprettes individuelt fra x, y, l, h verdier med Plugins ROI Specify ROI. kommando. Ratiometrisk bildebehandling sammenligner opptakene av to forskjellige signaler for å se om det er noen likheter mellom dem. Det gjøres ved å dele en kanal med en annen kanal for å produsere en tredje ratiometrisk kanal. Denne teknikken er nyttig fordi den korrigerer for fargelekkasje, ulik fargestoffbelastning og fotobleging. Et eksempel på søknad ville være å måle intracellulær ion, pH og spenningsdynamikk i sanntid. Bakgrunnsuttraksjon er nødvendig før analyse av tokanalsforholdsbilder. Se også bakgrunnskorrigeringsseksjonen. RatioProfiler-pluginet vil utføre ratiometrisk analyse av en enkelt avkastning på en dobbeltkanals interleaved stabell. Odd-skiver er kanal 1-bilder, og de samme skivene er kanal 2-bilder. Hvis de to kanalene dine åpnes som separate stabler, som Zeiss, kan de to kanalene blandes (blandes sammen ved å skifte mellom dem) med menykommandoen Plugins Stacks - Shuffling Stack Interleaver. Pluggen vil generere et grønt-plott av forholdsverdiene. Ch1Ch2 er standard og du kan få Ch2Ch1 hvis plugin kjøres med Alt-tasten nede. Det vil også generere et andre plott av intensiteten til de enkelte kanalene, Ch1 og Ch2, samt en resultattabell. Den første raden i resultattabellen inneholder verdier for x, y, bredde og høyde av avkastningen. Fra den andre raden nedover er den første kolonnen tiden (skive nummer), den andre kolonnen er Ch1-intensiteten, og den tredje kanalen er Ch2-intensiteten og forholdsverdien. Stakken må ha sitt rammeintervall kalibrert for at Time-verdien skal være i sekunder. Ellers er det skiver. Rammeintervallet kan settes for stabelen via menykommandoen Bildeegenskaper. Denne tabellen kan kopieres til utklippstavlen og lime inn andre steder med menyen Edit Edit All. Ratio Analyse Bruke avkastningsbehandler 1.Trekk bakgrunnen fra bildet. 2. Åpne ROI-leder (Analyser Verktøy avkastningsadministrator.) Og klikk Vis alle-knappen. 3. Velg cellene som skal analyseres, og legg dem til avkastningsbehandleren (Legg til-knapp eller tastatur T-tasten). 4. Kjør plugin. Resultatvinduet inneholder gjennomsnittet av ch1 og ch2 og deres forhold. Hver rad er et tidspunkt (skive). Den første raden inneholder avkastningsdetaljene. For å generere et referansebilde: Flat stakken med menykommandoen (Image Stacks Z-prosjektet med Projeksjonstype: Maksimum), Juster lysstyrken og kontrasten om nødvendig. Velg det nye bildet og klikk på knappen Mer i avkastningsbehandleren. Deretter velger du Etikett. Oppnå tidsstempeldata LSM-verktøykassen er et prosjekt som tar sikte på å integrere felles nyttige funksjoner rundt Zeiss LSM-filformatet, som skal øke brukervennligheten for konfokale LSM-filer som er oppbevart i sitt eget format, og dermed bevare alle tilgjengelige metadata. I Fiji er tilsvarende kommandoer: Fil Importer Vis LSMToolbox som viser verktøykassen, hvorfra alle kommandoer kan bli kalt og Hjelp Om Plugins LSMToolbox. som viser informasjon om plugin. Denne lesningen kan bli funnet ved å bruke menykommandoen Image Show Info. . Rull ned for å få den tiden hvert stykke ble kjøpt. Velg denne gangen, kopier den til Excel, og finn klokkeslettnummeret som ble oppnådd ved å bruke Excel-menykommandoen Rediger Erstatt. Dette vil bare etterlate tidsdataene. Den forløpte tiden kan da beregnes ved å subtrahere rad 1 fra alle etterfølgende rader. Linjeskanning innebærer å anskaffe en enkelt linje, en piksel i bredde, fra et felles konfokalmikroskop i stedet for et standard 2D-bilde. Dette er vanligvis en raskere måte å ta et bilde på. Alle de enkelte pikselbrede bildene blir deretter stablet for å gjenskape 2D-bildet. En pseudo-linescan generasjon av et 3-D (x, y, t) bilde. Det er nyttig for visning av 3-D data i 2 dimensjoner. En linje av interesse trekkes etterfulgt av kommandoen: Image Stacks Reslice eller med tastaturknappen. Det vil spørre deg om linjebredden du ønsker å bli gjennomsnittlig. Det vil generere en pseudo-linescan stabel med hver skisse som representerer pseudo-linjeskan av en enkeltpiksel bred linje langs linjen av interesse. Gjennomsnittlig pseudo-linescan stable ved å velge Image Stacks Z-Project. og bruk kommandoen Gjennomsnitt. En poly-linje kan benyttes, men dette vil bare generere en enkelt pikselskive. Fijis standardinnstillinger forutsetter at stabler er z-serier i stedet for t-serier. Dette betyr at mange funksjoner knyttet til tredje dimensjonen av en bildestabel refereres til med en z-. Bare hold dette i bakhodet. FRAP (Fluorescens Recovery etter Photobleaching) Analyse FRAP profiler plugin vil analysere intensiteten av et bleket ROI over tid og normalisere det mot intensiteten av hele cellen. Deretter finner du minimumsintensiteten i den bleke avkastningen og passer til utvinningen med dette punktet i tankene. Åpne avkastningsbehandleren. Tegn rundt den bleke avkastningen og legg den til avkastningsbehandleren. Tegn rundt hele cellen og legg til det til avkastningsbehandleren. Normaliseringen korrigerer for bleking som oppstår under bildeoppkjøpet, og antar at hele cellen er i synsfeltet. Pluginet utgjør den største av de to avkastningene i avkastningsbehandleren er hele celleavkastningen, og at den mindre avkastningen er den blekede delen. Kjør FRAP profiler plugin. Pluggen vil returnere intensiteten vs tidsplanen, den normaliserte intensiteten vs tidsplottet av det bleke området, og kurven passer. Ikke-lineær kontraststrekning Equalization Du kan ha mer kontroll over lysstyrke og kontrastjusteringer med kommandoen Prosessforbedre kontrast meny. Med en stabel analyserer den hvert skiverhistogram for å gjøre justeringen. Kommandoen Equalize Contrast anvender en ikke-lineær strekk av histogrammet basert på kvadratroten av intensiteten. Gamma utfører en ikke-lineær histogramjustering. Svake objekter blir mer intense mens lyse gjenstander ikke gjør det (gamma lt1). Også medium-intensitetsobjekter blir svakere mens lyse gjenstander ikke (gamma gt 1). Intensiteten til hver piksel heves til kraften til gammaverdien og deretter skaleres til 8-bits eller min og maksimalt 16-biters bilder. For 8-biters bilder Ny intensitet 255 (old intensity255) gamma Gamma kan justeres via kommandoen Process Math Gamma. Det vil tillate deg å justere gammaen med rullefeltet. Klikk på Ok når du er ferdig. Du kan bruke rullegardinmenyen til å bestemme ønsket gammaverdi på ett stykke av stabelen din. Det er også et alternativ for å forhåndsvise resultatene. Se online referanse for en forklaring på digitale filtre og hvordan de fungerer. Filtre kan bli funnet ved hjelp av menykommandoen Prosessfiltre. . Gjennomsnittlig filter. pikselet erstattes med gjennomsnittet av seg selv og naboene innenfor den angitte radius. Menyelementet Process Smooth er et 33 gjennomsnittlig filter. Gaussisk filter. Dette ligner et utjevningsfilter, men erstatter i stedet pikselverdien med en verdi proporsjonal med en normal fordeling av naboene. Median filter. Pikselverdien erstattes med medianen av seg selv og nabostillingene. Dette fjerner støy og opprettholder grenser bedre enn enkel gjennomsnittlig filtrering. Menyelementet Process Noise Despeckle er et 33-medianfilter. Convolve filter: Dette gjør det mulig å multiplisere to tallrike tall sammen. Arrays kan være forskjellige størrelser, men må ha samme dimensjon. I bildeanalyse er denne prosessen vanligvis brukt til å produsere et utgangsbilde der pikselverdiene er lineære kombinasjoner av bestemte inngangsverdier. Minimum: Dette filteret, også kjent som et erosjonsfilter, er et morfologisk filter som vurderer nabolaget rundt hver piksel, og fra denne listen av naboer bestemmer minimumsverdien. Hver piksel i bildet blir da erstattet med den resulterende verdien generert av hvert nabolag. Maksimum: Dette filteret, også kjent som et dilatasjonsfilter, er et morfologisk filter som vurderer nabolaget rundt hver piksel, og fra denne listen av naboer bestemmer maksimumsverdien. Hver piksel i bildet blir da erstattet med den resulterende verdien generert av hvert nabolag. Kalman filter. Dette filteret, også kjent som den lineære kvadratiske estimeringen, opererer rekursivt på støyende innganger for å beregne et statistisk optimalt estimat av den underliggende systemtilstanden. Bakgrunnskorrigering kan gjøres på flere måter. En enkel metode er å bruke Image Lookup Tables HiLo LUT til å vise nullverdier som blå og hvite verdier (pikselverdi 255) som rød. Med en bakgrunn som er relativt jevn over bildet, fjerner du den med kommandoen BrightnessContrast ved å øke minimumsverdien sakte til det meste av bakgrunnen vises blå. Trykk på Bruk-knappen for å gjøre en permanent endring. Rolling-Ball bakgrunnskorreksjon For å fikse en ujevn bakgrunn, bruk menykommandoen Process Subtract Background. Dette vil bruke en rullende ballalgoritme på den ujevne bakgrunnen. Radien skal settes til minst størrelsen på det største objektet som ikke er en del av bakgrunnen. Det kan også brukes til å fjerne bakgrunnen fra geler der bakgrunnen er hvit. Kjører kommandoen flere ganger kan gi bedre resultater. Brukeren kan velge om den skal ha en lys bakgrunn, lage en bakgrunn uten subtraksjon, ha en glidende paraboloid, deaktiver utjevning eller forhåndsvisning av resultatene. Standardverdien for rullende kulediameter er 50 piksler. Prosess trekker tilbake bakgrunnen. Taupatologi inducerer eksitatorisk neurosvikt, gridcelledysfunksjon og romlig minnefeil som minner om tidlig Alzheimers sykdom Hongjun Fu 1,4 Gustavo A. Rodriguez 1,4 Mathieu Herman 1 Sheina Emrani 1 Eden Nahmani 1 Geoffrey Barrett 1 Helen Y Figueroa 1 Eliana Goldberg 1 S. Abid Hussaini 1,2,4,. Karen E. Duff 1,2,3,5,. 1 Taub Institutt for forskning om Alzheimers sykdom og aldringshjernen, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 2 Institutt for patologi og cellebiologi, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 3 Institutt for integrativ nevrovitenskap , New York State Psychiatric Institute, New York, NY 10032, USA Mottatt 20. juli 2016. Revidert 20. oktober 2016. Godkjent 15. desember 2016. Tilgjengelig online 19. januar 2017. Publisert: 19. januar 2017 Høydepunkter Tau-patologi induserer romlig minneunderskudd i gammel , men ikke unge, EC-Tau-mus. Aged EC-Tau-mus viser gridcellehypoaktivitet og redusert periodicitet. Excitatoriske, men ikke inhibitoriske, MEC-neuroner er sårbare for tau-patologi. Endret nevronaktivitet korrelerer med neurodegenerasjon i gammelt EC-Tau. De tidligste stadiene av Alzheimers sykdom (AD) er preget av dannelsen av modne tangles i entorhinal cortex og desorientering og forvirring når man navigerer til kjente steder. Medial entorhinal cortex (MEC) inneholder spesialiserte nevroner kalt gridceller som inngår i det romlige navigasjonssystemet. Her viser vi i en transgen musemodell som uttrykker mutant menneskelig tau overveiende i EU at dannelsen av modne tangles i gamle mus var assosiert med excitatorisk celle tap og mangler i rutenettfunksjonen, inkludert destabiliserte rutenettfelt og reduserte avfyringshastigheter, så vel som endret nettverksaktivitet. Overt tau-patologi hos de gamle musene ble ledsaget av romlig minneunderskudd. Derfor kan tau-patologi initiert i entorhinal cortex føre til underskudd i gridcellens avfyring og underliggende forverringen av romlig kognisjon sett i menneskelig AD. tau patologi Alzheimers sykdom entorhinal cortex grid celler neuronal tap kognitive underskudd neurofibrillær tangles romlig minne elektrofysiologi hypoaktivitet Figur 1. Figur 2. Figur 3. Figur 4.November 04, 2010 Følgende informasjon er en oppdatert versjon av en metode for å bruke ImageJ til å analysere western blots fra en nå utdatert eldre side. Hvis du ser etter et mer omfattende arbeidsflytalternativ for dine western blot-analyser, kan du gå til min veiledning om bruk av Image Studio Lite. en gratis programvarepakke fra LI-COR Biosciences. Image Studio Lite-programvaren kan lastes ned gratis fra licorislite. I tillegg til funksjonaliteten beskrevet nedenfor for ImageJ, tilbyr Image Studio Lite ytterligere dataadministrasjonsfunksjoner sammen med annoteringsverktøy for å produsere publikasjonsklare bilder av dine vestlige. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) kan brukes til å sammenligne tettheten (aka intensitet) av band på en agargel eller western blot. Denne opplæringen antar at du har båret din gel eller blotte gjennom visualiseringstrinnet, slik at du har et digitalt bilde av gelen din i. tif. jpg. png eller andre bildeformater (en 16-bit. tif ville være det foretrukne formatet for å beholde den maksimale mengden informasjon i det opprinnelige bildet). Hvis du skanner røntgenfilm på en flatbed-skanner, må du sørge for at du bruker en skanner med muligheten til å skanne transparenter (dvs. film), og bruk skannersoftware til å lagre 16-biters tiff-bilder. Se referansene i slutten av denne opplæringen for en diskusjon av de ulike måtene du kan skru opp dette trinnet. Dette forutsetter også at du ikke overbelastte ditt blottbild da du produserte det. For en forklaring på hvorfor overeksponering vil ødelegge resultatene dine, se denne siden. Metoden som er skissert her bruker Gel Analysis-metoden som er skissert i ImageJ-dokumentasjonen: Gel Analysis. Du kan foretrekke å bruke den i stedet for metodene jeg skisserer nedenfor. Det bør være svært lite forskjell mellom resultatene oppnådd fra de ulike metodene. Denne versjonen av opplæringen ble opprettet ved hjelp av ImageJ 1.42q på en Windows 7 64-bit installasjon. 1. Åpne bildefilen ved å bruke FilegtOpen i ImageJ. 2. Gelanalyserutinen krever at bildet skal være et gråskala bilde. Den enkleste metoden for å konvertere til gråtoner er å gå til ImagegtTypegt8-bit. Bildet ditt skal se ut som Figur 1. Figur 1. Et fabrikkert western blot-bilde åpnet i ImageJ. Informasjonen øverst på bildet indikerer at bildet er for tiden i 8-biters modus, ved hjelp av en inverterende LUT (oppslagstabell). Den inverterende LUT sikrer at mørke bånd blir registrert som høyere tetthetsverdier. 3. Velg verktøyet Rektangulært valg fra ImageJ-verktøylinjen. Tegn et rektangel rundt den første banen. ImageJ antar at banene dine løper vertikalt (så enkelte bånd er horisontale), så rektangelet skal være høyt og smalt for å legge til en enkelt bane. Hvis du tegner et rektangel som er kort og bredt, vil ImageJ bytte til å antar at banene løper horisontalt (enkelte bånd er vertikale), noe som fører til mye forvirring. Figur 2. Den første banen er valgt med verktøyet Rektangulært valg 4. Når du har tegnet rektangelet over den første banen, trykker du på tasten 1 (Kommandoen 1 på Mac) (Kommando 1 på Mac) eller går til AnalysegistrertGelg VelgVelg for å angi rektangel på plass. Første lane vil nå bli uthevet og ha en 1 i midten av den. 5. Bruk musen til å klikke og hold midt i rektangelet på 1. lane og dra den over til neste lane. Du kan også bruke piltastene til å flytte rektangelet, selv om dette er tregere. Senter rektangelet over banen til venstre, men ikke bekymre deg om at det er perfekt på samme vertikale akse. Image-J vil automatisk justere rektangelet på samme vertikale akse som det første rektangel i neste trinn. 6. Trykk 2 (Command 2 på Mac) eller gå til AnalyzegtGelsgtSelect Next Lane for å sette rektangelet på plass over 2. lane. A 2 vises i banen når rektangelet er plassert. 7. Gjenta trinn 5 6 for hver påfølgende lane på gelen, og trykk 2 (Command 2 på Mac) hver gang for å sette rektangelet på plass (figur 3). Figur 3. Plasser rektangelet over hver bane, trykk 2 hver gang for å sette rektangelet på plass. 8. Etter at du har satt rektangelet på plass på siste felt (ved å trykke 2), trykk 3 (Kommando 3 på Mac), eller gå til AnalyzegtGelsgtPlot Lanes for å tegne en profilplan for hver lane. Figur 4. Profilbildet fra eksempelet western blot. 9. Profilbildet representerer den relative tettheten av innholdet i rektangelet over hver bane. Rektanglene er ordnet opp til bunn på profilplottet. I eksempelet western blot-bilde svarer toppene i profilplottet (figur 4) til de mørke båndene i det opprinnelige bildet (figur 3). Fordi det var valgt fire baner, er det fire seksjoner i profilplottet. Høyere topper representerer mørkere bånd. Bredere topper representerer band som dekker et bredere størrelsesområde på den opprinnelige gelen. 10. Bilder av ekte gels eller western blots vil alltid ha noe bakgrunnssignal, slik at toppene don8217t kommer ned til grunnlinjen til profilplottet. Figur 5 viser en topp fra en ekte flass hvor det var litt bakgrunnsstøy, så toppen ser ut til å flyte over grunnlinjen til profilplottet. Det vil være nødvendig å lukke toppen slik at vi kan måle størrelsen. Figur 5. Real western blots har ofte litt bakgrunnsstøy, slik at toppen ikke nås til grunnlinjen (perfekt hvit). 11. Velg verktøylinjen Straight Line (Bilde 6). For hver topp du vil analysere i profilplottet, tegne en linje over toppen av toppen for å legge toppen (figur 5). Dette trinnet krever noen subjektiv vurdering fra din side for å bestemme hvor toppen slutter og bakgrunnsstøyen begynner. Figur 6. Bruk rettlinjeverktøyet til å lukke bunnen av hver topp av interesse. Figur 7. Toppet fra figur 5 er vist med en linje trukket over toppen av toppen for å omslutte toppområdets område. 12. Merk at hvis du har markert mange baner, vil de senere banene være skjult nederst på profilplottvinduet. For å se disse banene, trykk og hold mellomromstasten, og bruk musen til å klikke og dra profilplottet oppover. 13. Når hver topp er stengt ved basen med verktøylinjen Straight Line, velg Wand-verktøyet fra ImageJ-verktøylinjen (Figur 8). Figur 8. Velg Wand-verktøyet for å markere hver topp av interesse på profilplottet. 14. Bruk mellomromstasten og musen til å dra profilplanen nedover til du er tilbake på første kjørefelt. Med Wand-verktøyet klikker du inne i toppen (Figur 9). Gjenta dette for hver topp mens du går ned på profilplottet. For hver topp som du markerer, må målinger dukke opp i resultatvinduet som vises. Figur 9. Klikk inn i den første toppen av interesse med Wand-verktøyet. Toppet skal utheves og en måling skal dukke opp i resultatvinduet. 15. Når alle toppene har blitt uthevet, gå til AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Dette merker hver topp med sin størrelse, uttrykt som en prosentandel av den totale størrelsen på alle de fremhevede toppene. 16. Verdiene fra resultatvinduet (Figur 10) kan flyttes til et regnearksprogram ved å velge EditgtCopy All i resultatvinduet. Lim inn verdiene i et regneark. Figur 10. Utgangen fra valg av topper i profilplottet og merking av toppene. I dette tilfellet er resultatene fra å velge det øvre båndet i hver av de 4 banene i eksemplet western blot fra figur 1. Merk: Hvis du ved et uhell klikker på feil sted med Wand. Programmet registrerer fortsatt som klikket område som topp, og det vil faktorere i det totale arealet som brukes til å beregne prosentverdiene. Selvfølgelig vil dette skje resultatene dine hvis du klikker på områder som aren8217t toppene. Hvis du tilfeldigvis klikker på feil sted, går du enkelt til AnalyzegtGelgtLabel Peaks for å plotte de nåværende resultatene, som viser feilverdiene, men nullstiller telleren for resultatvinduet enda viktigere. Gå tilbake til profilplottet og begynn å klikke inne i toppene igjen, begynner med den første toppen av interesse. Resultatvinduet skal slette og begynne å vise de nye verdiene. Når du er sikker på at du klikker i alle de riktige toppene uten å klikke ved et uhell på noen feilområder, kan du gå tilbake til AnalyzegtGelsgtLabel Peaks og få de riktige resultatene. Dataanalyse Med dataene limt inn i et regneark, kan du nå beregne den relative tettheten av toppene. Som en påminnelse er verdiene som beregnes av ImageJ, hovedsakelig vilkårlige tall, de har bare mening i sammenheng med settet av topper som du valgte på det enkelt gelbildet du har jobbet på. De har ikke enheter av g protein eller andre virkelige enheter som du kan tenke på. Den normale prosedyren er å uttrykke tettheten til de valgte bandene i forhold til noen standardbånd som du også valgte i løpet av denne prosessen. 1. Plasser dataene dine i et regneark. En av toppene bør være din standard. I dette eksemplet bruker we8217ll den første toppen som standarden. 2. I en ny kolonne ved siden av kolonnen Prosent deles prosentverdien for hver prøve med prosentverdien for standarden (den første toppen i dette tilfellet, 26.666). 3. Den resulterende kolonnen av verdier er et mål på den relative tettheten i hver topp sammenlignet med standarden, som åpenbart vil ha en relativ tetthet på 1. Figur 11. Beregner relativ tetthet for hver av de 4 fremhevede topper. Vi bruker prøve 1 som standard for denne gelen. Relativ tetthet beregnes ved å dele prosentverdien for hver prøve med prosentverdien for standarden. 4. I dette eksemplet har den andre banen en høyere relativ tetthet (1,86), som tilsvarer godt med størrelsen og mørket i det opprinnelige bildet (figur 1). Husk at disse dataene er for den øvre rækken av bånd på det opprinnelige western blot-bildet. 5. Hvis du vil sammenligne tettheten av prøver på flere geler eller flekker, må du bruke samme standardprøve på hver gel for å gi en felles referanse når du beregner Relative Density-verdiene. Se seksjonene nedenfor for en nærmere beskrivelse av disse kravene. 6. For å teste for signifikante forskjeller mellom behandlinger i et eksperiment, må alle dine geler eller blotter skannes og kvantifiseres ved hjelp av denne metoden, og verdiene vil bli uttrykt i forhold til relativ tetthet, eller du kan behandle relativ tetthet som en fold-endringsverdi (dvs. en relativ tetthetsdifferanse på 2 mellom en kontroll og en behandling vil indikere en 2-gangs endring i uttrykket). Hvis du skal bruke analysen av variantteknikker for å teste dataene dine, må du kanskje sørge for at relativ tetthet verdier er normalt fordelt og at det er homogenitet av varians blant de ulike behandlingene. 7. Det bør bemerkes her at enkelte forskere gjør ekstra innsats for å inkludere et sett med serielle fortynninger av en kjent standard på hver blot. Ved bruk av seriell fortynningskurve og kvantifiseringsteknikker som er skissert ovenfor, bør det være mulig å uttrykke prøvebåndene dine i form av piktogrammer eller nanogrammer av protein. Et mer involvert eksempel ved bruk av lastkontroll. We8217ll bruker figur 12 som en representativ western blot. På denne flekken vil vi late som vi lastet inn fire replikatprøver av protein (fire pipettbelastninger fra samme hetteglass med homogenat), slik at vi forventer at tetthetene i hver bane blir ekvivalente. Den øvre raden av stolper representerer vårt protein av interesse. Det nedre settet av barer representerer vårt lastekontrollprotein, som er ment å sikre at en lik mengde totalt protein ble lastet i hver bane. Dette lastekontrollproteinet er et protein som antas å være uttrykt på et konstant nivå, uavhengig av behandlingen som brukes på de opprinnelige organismer, for eksempel aktin (selv om mange vil stille spørsmål om at aktin vil bli uttrykt likeverdig på tvers av behandlinger). Figur 12. Et eksempel på western blotting med en nedre rad belastningsbånd. Ofte vil disse bandene representere et protein som antas å bli uttrykt likeverdig i alle behandlinger, for eksempel actin. Ser vi på figur 12, hadde vi håpet å laste tilsvarende mengder totalt protein i hver bane, men etter å ha kjørt den vestlige blottet varierer størrelsen og intensiteten til de nedre bjelkene i hver bane ganske mye. De to venstre banene virker likeverdige, men den tredje banen har halv tetthet (grå verdi) sammenlignet med banene 12, mens bane 4 har halv tetthet og halve størrelsen i forhold til baner 12. Fordi belastningskontrollene våre er så forskjellige, verdier av det øvre settet av bånd kan ikke være direkte sammenlignbare. We8217ll bruker ImageJ8217s gelanalyseringsrutine for å kvantifisere tettheten og størrelsen på blottene, og bruk resultatene fra våre lastkontroller (lavere bånd) for å skalere verdiene for vårt protein av interesse (øvre bånd). 1. Åpne western blot-bildet i ImageJ. 2. Kontroller at bildet er i 8-biters modus: gå til ImagegtTypegt8-bit. 3. Bruk rektangulærverktøyet til å tegne en boks rundt hele 1. lane (både øvre og nedre søyle inkludert. 4. Trykk på 822018221 (eller Kommando 1 på Mac) for å sette rektangelet. A 822018221 skal vises midt i rektangelet. 5. Klikk og hold midt i rektangelet, og dra det over 2. lane. 6. Trykk 822028221 (Command 2 på Mac) for å sette rektangelet for lane 2. A 822028221 skal vises midt i rektangelet. Gjenta trinn 5 6 for hver påfølgende lane, trykk 822028221 (Command 2 på Mac) for å sette rektangelet over hver etterfølgende lane (se figur 13). Figur 13. Hver lane er valgt ved å flytte rektanglet over det og trykke 822028221 for å sette rektangelet på plass. 8. Når du har lagt den siste banen (og trykket 822028221 for å sette den på plass), kan du trykke 822038221 for å lage et plott av de valgte banene (se figur 14). Figur 14. Profilplott av hver lane (ordnet med lane 1 øverst, lane 4 nederst). Du må kanskje bla gjennom t han vindu for å se alle banene. 9. Profilbildet representerer i hovedsak gjennomsnittlig tetthetsverdi over et sett med horisontale skiver av hver bane. Mørkere blotter vil ha høyere topper, og blott som dekker et større størrelsesområde (kD), vil ha større topper. I vårt eksempel western blott er bandene perfekte rektangler, men du vil legge merke til en viss skråning i profilplottingstoppene, da ImageJ bruker litt gjennomsnittlig tetthetsverdier når den beveger seg fra topp til bunn av hver bane. As a result, the sharp transition from perfect white to perfect black on the bands of lane 1 is translated into a slight slope on the profile plot due to the averaging. 10. On our idealized western blot used here, there is no background noise, so the peak reaches all the way down to the baseline of the profile plot. In real western blots, there will be some background noise (the background will not be perfectly white), so the peaks won8217t reach the baseline of the profile plot (see figure 5 above). As a result, each plot will need to have a line drawn across the base of the peak to close it off. 11. Choose the Straight Line selection tool from the ImageJ toolbar. For each peak you want to analyze in the profile plot, draw a line across the base of the peak to enclose the peak (Figure 7). This step requires some subjective judgment on your part to decide where the peak ends and the background noise begins. 12. When each peak of interest is closed off with the straight line tool, switch to the Wand tool. We will use the wand tool to highlight each peak of interest so that Image-J can calculate its relative areadensity. 13. We will start by highlighting the loading-control bands (lower row) on our example western blot. Beginning at the top of the profile plot, use the wand to click inside the 1st peak (Figure 15). The peak should be highlighted after you click on it. Continue clicking on the loading-control peaks for the other lanes. If a lane is not visible at the bottom of the profile plot, hold down the space bar and click-and-drag the profile plot upwards to reveal the remaining lanes. Figure 15. Click inside the loading-control peak with the wand tool. Click on each of the loading-control peaks for the remaining lanes (ignore the protein lanes to the left for now). 14. When the loading control peak for each lane has been highlighted with the wand, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Each highlighted peak will be labeled with its relative size expressed as a percentage of the total area of all the highlighted peaks. You can go to the Results window and choose EditgtCopy All to copy the results for placement in a spreadsheet. Figure 16. Area and Percent values for our loading-control bands from the example western blot. Lanes 1 and 2 are equal, as we expect by looking at the original bands on the western blot (Figure 12). 15. Repeat steps 13 14 for the real sample peaks now. We are selecting these peaks separately from the loading-control peaks so that those areas are not factored into the calculation of the density of our proteins-of-interest. As before, use the Wand tool to click inside the area of the peak in the 1st lane, then continue clicking inside the peaks of the remaining lanes. When finished, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks to show the results. Copy the results to a spreadsheet alongside the data for the loading-control bands (Figure 17). Figure 17. Results from the loading-control bands (labeled 8220stds8221 here) and the sample protein peaks (the upper row of bands on the original western blot). Data Analysis with loading-control bands 1. With all of the relative density values now in the spreadsheet, we can calculate the relative amounts of protein on the western blot. Remember that the 8220Area8221 and 8220Percent8221 values returned by ImageJ are expressed as relative values, based only on the peaks that you highlighted on the gel. Start the analysis by calculating Relative Density values for each of the loading-standard bands. In this case, we8217ll pretend that Lane 1 is our control that we want to compare the other 3 lanes to. Divide the Percent value for each lane by the Percent value in the control (Lane 1 here) to get a set of density values that is relative to the amount of protein in Lane 18217s loading-control band (Figure 18). Figure 18. Calculate Relative Density values by dividing the Percent values in each row by the control sample8217s Percent value (Lane 1, 40.828, in our example). 2. Next we8217ll calculate the Relative Density values for our sample protein bands (upper row on the example western blot). We carry out a similar calculation as step 1, dividing the Percent value in each row by the Percent value of our control8217s protein band (Lane 1 here). Figure 19. Calculate Relative Density values for the Samples as well, using the Percent value for your control protein band (Lane 1, 40.585 here). Note: Recall that because some of our loading-control bands were wildly different on the original western blot, we can8217t simply use the Relative Density values from our Samples calculated in Step 2 as the final results. Now it is necessary to scale the Relative Density values for the Samples by the Relative Density of the corresponding loading-control bands for each lane. We do this based on the assumption that the proportional differences in the Relative Densities of the loading-control bands represent the proportional differences in amounts of total protein we loaded on the gel. In our example western blot, we have evidence of massively different amounts of total protein in each sample (poor pipetting practice, probably). 3. The final step is to scale our Sample Relative Densities using the Relative Densities of the loading-controls. On the spreadsheet, divide the Sample Relative Density of each lane by the loading-control Relative Density for that same lane. Figure 20. Adjusted Density values (yellow cells) for our samples were calculated by dividing the Relative Density of each Sample lane by the Relative Density of the loading-control for the same lane. For example, the Relative Density for Sample 4 (0.1628) was divided by the Relative Density for the loading-control in Lane 4 (0.154379) to get an Adjusted Density value of 1.054. 4. When we created our imaginary example western blot, we expected to get equivalent amounts of the protein of interest in each lane, because we (hypothetically) loaded equivalent sample volumes of protein from the same vial of homogenate in each lane. During the loading process, something went awry, and we got very different densities on the western blot. But after carrying out the loading-control corrections above, we find that our Adjusted Densities for each of the 4 lanes are roughly equivalent (all are approximately 1), indicating that there are equivalent ratios of the protein of interest contained within the sample of total protein in each lane, as we would expect. The example above represents a special case. In reality, you will typically be skilled enough to pipette equivalent amounts of total protein into your gel lanes, presumably because you have used a process like the BCA Protein Assay to quantify the total amount of protein present in each of your homogenate samples. This can obviate the need for the loading-control bands and the associated controversy about whether the protein you8217re using to assess equal loading is truly expressed consistently across all treatment levels. Extending the example to multiple western blots If you can apply equal amounts of total protein to each lane of a gel, then you only need to concern yourself with having an appropriate standard sample placed on each western blot you run for the project. For example, you might purchase an aliquot of purified Human Hsp70 and place 1l in a lane on each gel you run when probing for Hsp70. Or you might save some money by creating your own standard sample by mixing aliquots of several of your homogenates to make a large quantity of mixed homogenate that you can use to load a standard volume onto a single lane of each gel for your entire project (running out of this mixture part way through your project would be a Bad Thing). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i. e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed.
No comments:
Post a Comment